انواع دتکتور در دستگاه HPLC
مقدمه
در داخل ستون کروماتوگرافی یا همان ستون HPLC ، جداسازی واقعی اجزای موجود در نمونه از یکدیگر، انجام میشود. این اجزای جداسازی شده در ستون HPLC باید «جمعآوری» شوند تا ما بتوانیم آنها را مشاهده کنیم. برای این منظور از آشکارسازها یا همان دتکتور HPLC استفاده میشود. در آشکارساز، اجزای جداسازی شده بررسی شده و به صورت الکترونیکی نشان داده میشوند. هیچ آشکارسازی وجود ندارد که بتواند تمامی ترکیبات موجود را شناسایی کند، به همین دلیل در آنالیز دستگاه HPLC از چندین آشکارساز مختلف استفاده میشود. در ادامه با انواع دتکتور HPLC آشنا می شویم:
دتکتور UV-VIS و دتکتور PDA
آشکارسازهای UV، VIS و PDA جزو آشکارسازهای جذبی میباشند. حساسیت این آشکارسازها برای ترکیبات جذبکنندهی نور بسیار بالا و در حد پیکوگرم است. کار با این آشکارسازها بسیار آسان است و پایداری خوبی نیز دارند.
دتکتور UV یک آشکارساز بسیار پرکاربرد در آنالیزهای دستگاه HPLC است. در طی فرآیند آنالیز، نمونه به یک سلول شیشهای بی رنگ و شفاف که به آن سلول جریان گفته میشود، وارد میشود. هنگامی که نورUV به سلول جریان تابیده میشود، نمونه بخشی از این نور را جذب میکند. بنابراین شدت نور UV مشاهده شده در فاز متحرک (فاقد نمونه) و فاز شویشی (حاوی نمونه) با یکدیگر متفاوت خواهد بود. از طریق اندازهگیری این اختلاف میتوان مقدار نمونه موجود را تعیین کرد. از آنجا که میزان جذب UV به طول موج مورد استفاده آن نیز بستگی دارد، باید یک طول موج مناسب بر اساس نوع آنالیت انتخاب شود. یک دتکتور UV استاندارد امکان انتخاب طول موج بین 195 تا 370 نانومتر را به کاربر میدهد. پرکاربردترین طول موجی که از آن استفاده میشود، 254 نانومتر است.
آشکارساز VIS در مقایسه با آشکارساز UV از طول موج بلندتری (400 تا 700 نانومتر) استفاده میکند. همچنین آشکارسازهایی وجود دارند که دارای طول موج وسیعتری هستند و هر دو ناحیه UV و VIS (195 تا 700 نانومتر) را پوشش میدهند که به آنان آشکارساز UV-VIS گفته میشود.
دتکتور PDA کل طیف را به طور همزمان شناسایی میکند. آشکارسازهای UV و VIS نتیجهی به دست آمده را در دو بعد (شدت نور و زمان) نشان میدهند، اما PDA حاوی بعد سوم (طول موج) نیز هست. این آشکارساز برای تعیین بهترین طول موج بدون تکرار آنالیز مناسب است.
دتکتور RID (ضریب شکست)
آشکارساز ضریب شکست میزان تغییر در ضریب شکست را اندازهگیری میکند. در این آشکارساز، یک دیواره شیشهای محفظه را به دو نیمه (سل) تقسیم میکند. جریان خروجی از ستون کروماتوگرافی مایع وارد «سل نمونه» میشود، در حالی که سل دیگر که «سل مرجع» نامیده میشود تنها با فاز متحرک پر شده است. هنگامی که جریان خروجی وارد شده از ستون به سلول نمونه، حاوی هیچ آنالیتی نباشد، حلال موجود در هر دو سل یکسان است. در این حالت پرتوی تابیده شده به سلها دارای مسیر مستقیم خواهد بود. اما زمانی که جریان خروجی از ستون حاوی ترکیب دیگری به غیر از فاز متحرک باشد، پرتو ورودی به دلیل اختلاف ضریب شکست بین دو حلال منحرف میشود. از طریق اندازهگیری این تغییر در پرتو تابشی، میتوان حضور ترکیبات را مشخص نمود.
آشکارساز RI (ضریب شکست) حساسیت کمتری نسبت به آشکارساز UV دارد، و این امر دلیل استفادهی کمتر از این آشکاساز نسبت به آشکارساز UV است.
مزایای دتکتور RID
آشکارساز ضریب شکست مزایای زیادی دارد. این آشکارساز برای شناسایی تمامی ترکیبات مناسب است. به عنوان مثال، نمونههایی که جذب UV ندارند (مانند شکر، الکل و یونهای معدنی) با استفاده از آشکارساز UV قابل اندازهگیری نیستند. اما تغییر ضریب شکست در تمامی ترکیبات رخ میدهد. بنابراین میتوان از آشکارساز ضریب شکست برای اندازهگیری تمامی آنالیتها استفاده نمود.
این آشکارساز برای حلالهایی که در نور UV جذب دارد مناسب است. هنگام استفاده از حلالهایی که در نور UV جذب دارند، نمیتوان از آشکارساز UV استفاده کرد. برخی مواقع حلالهای آلی مورد استفاده در آنالیز GPC (مخفف Gel permeation chromatography) نیز دارای جذب UV هستند، به همین دلیل نمیتوان از آشکارساز UV استفاده نمود.
در آشکارساز ضریب شکست، رابطه مستقیمی بین شدت پیک و غلظت وجود دارد. مقدار UV جذب شده به نوع هر آنالیت بستگی دارد. بنابراین شدت پیک در آشکارساز UV اطلاعاتی از غلظت آنالیت به ما نمیدهد. در حالی که شدت پیک مشاهده شده توسط آشکارساز ضریب شکست با غلظت آنالیت مرتبط است.
با توجه به مزایای ذکر شده برای ضریب شکست ، اغلب از این آشکارساز برای شناسایی قندها و آنالیزSEC (مخفف Size-exclusion chromatography) استفاده میشود.